La PCR

PCR : Réaction en Chaine par Polymérase

 

Contrairement aux tests rapides, la PCR ne fonde pas le dépistage du FIV sur la présence ou absence des anticorps, mais sur la présence d'ADN proviral. Le test est pratiqué en laboratoire et le résultat est disponible en 24 heures.

 

La PCR permet de détecter le virus à l'état libre dans le sang (principalement pratiqué dans le dépistage standard du FIV), mais aussi dans les tissus et sécrétions diverses.

Le principe consiste à amplifier un partie du génome virale intégré dans le génome des cellules du chat infecté, en répliquant successivement ce fragment du génome viral. L'électrophorèse ou l'hybridation marquée permet de mettre en évidence les fragments obtenus.

Une PCR classique se déroule en trois étapes.

Avant de lancer la PCR, il convient d'extraire l'ADN de l'échantillon à analyser. Cet extrait est ensuite purifié. L'ADN à amplifier est ensuite mis en tube avec d'autres éléments nécessaires à la réaction : enzyme polymérase, desoxyribonucleotides, amorces, etc...

La PCR requiert l'utilisation d'un appareil spécifique : un thermocycleur, lequel permet notamment de régler les températures en fonction des différentes étapes. Les tubes à analyser sont mis dans ce thermocycleur et celui-ci est programmé pour effectuer les différents cycles. La PCR peut commencer.

 

1ere étape : La dénaturation.

Le tube à analyser est soumis à une température supérieure à 90°.

L'ADN se dénature alors. Une telle température rend instable les liaisons hydrogènes qui relient les deux brins de l'ADN. Ainsi, le double-brin de l'ADN se sépare en deux brins simples.

 

2eme étape : L'hybridation.

La température est descendue entre 40° et 60°, et est définie plus précisément en fonction des amorces.

Les amorces vont ainsi pouvoir se fixer aux brins simples d'ADN. Les amorces étant choisies en fonction de l'agent pathogène à rechercher, elles vont se fixer que sur le fragment correspondant au génome viral du brin. Ce principe de fixation est « l'hybridation ».

 

3eme étape : L'élongation.

La température est portée à 72°.

Lors de cette étape, les desoxyribonucleotides libres présents dans le tube vont se lier aux brins simples d'ADN, sur les fragments où l'amorce ne s'est pas déposés, grâce à l'action de l'enzyme polymérase.

Deux nouveaux brins sont alors synthétisés.

Le premier cycle est terminé. Un autre cycle se lance. Et ainsi dessuite...

Au total, 30 à 40 cycles sont effectués, permettant ainsi de multiplier le fragment initial et d'obtenir des milliards de fragments semblables.

PCR en temps réel.

La PCR en temps réel se pratique comme une PCR classique.

La différence réside dans l'utilisation d'une sonde fluorescente. Cette sonde permet l'hybridation sur le fragment cible. Les marqueurs fluorescents vont s'hybrider avec les fragments de l'ADN de l'agent pathogène recherché. Si ces fragments sont absents, les marqueurs fluorescents ne se fixeront pas.

Cette méthode augmente la sensibilité de la PCR. En effet, une fluorescence, même faible, pourra être mise en évidence après plusieurs cycles (et si fluorescence il y'a, c'est que génome viral il y'a). Alors que l'électrophorèse d'une PCR classique pourra donner un résultat négatif.

 

Contrairement à la PCR classique, la PCR en temps réel mesure l'amplification à la fin de chaque cycle. Le marqueur fluorescent permet d'évaluer la quantité d'ADN à chaque cycle d'amplification, son émission étant proportionnelle à la quantité de doubles brins d'ADN amplifiés par la PCR. Ainsi, l'ADN viral peut être quantifié tout au long de le réaction, et non à la fin de celle-ci.

 

La PCR en temps réel est donc plus sensible et plus précise que la PCR classique. Elle permet de détecter le génome viral de façon plus sûre que la PCR classique, et permet également de quantifier l'ADN viral tout au long de la procédure.

Les limites de la PCR

La PCR ne détecte pas toutes les souches du FIV. Si la souche dont est atteint le chat n'est pas celle recherché par la PCR, un résultat négatif pourra apparaître alors que le chat est infecté.

Le seuil de détection peut également poser problème. Bien que les tests PCR soient plus « poussés » que les tests rapides, si la charge virale se trouve sous le seuil de détection du PCR, un résultat négatif peut également survenir. Cela peut arriver notamment lors de la phase asymptomatique.

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